Contenuto
- Fusione! Fusione!
- Cerniere magnetiche
- I magneti più forti si attaccano più strettamente
- Il punto a metà strada
La reazione a catena della polimerasi, o PCR, è una tecnica che fotocopia un frammento di DNA in molti frammenti - esponenzialmente molti. Il primo passo è nella PCR: riscaldare il DNA in modo che si denaturi o si sciolga in singoli filamenti. La struttura del DNA è come una scala di corda in cui i pioli sono corde con estremità magnetiche. I magneti si collegano per formare i pioli, chiamati coppie di basi, e quindi resistono all'essere separati. Ogni frammento di DNA si scioglie in singoli filamenti a temperature diverse. Comprendere in che modo la struttura del DNA è tenuta insieme dalle singole parti del DNA consentirà di capire perché diversi frammenti di DNA si fondono a temperature diverse e perché sono necessarie temperature così elevate in primo luogo.
Fusione! Fusione!
Il primo passo della PCR è fondere il DNA in modo che il DNA a doppio filamento si separi in DNA a singolo filamento. Per il DNA dei mammiferi, questo primo passo di solito comporta un calore di circa 95 gradi Celcius (circa 200 Fahrenheit). A questa temperatura i legami idrogeno tra le coppie di basi A-T e G-C, o pioli nella scala del DNA, si rompono, decomprimendo il DNA a doppio filamento. Tuttavia, la temperatura non è abbastanza calda per rompere la spina dorsale di zucchero fosfato che forma i singoli fili o i poli della scala. La completa separazione dei singoli fili li prepara per il secondo passaggio della PCR, che si raffredda per consentire a brevi frammenti di DNA, chiamati primer, di legare i singoli fili.
Cerniere magnetiche
Uno dei motivi per cui il DNA viene riscaldato all'alta temperatura di 95 gradi Celcius è che più lungo è il doppio filamento di DNA, più vuole stare insieme. La lunghezza del DNA è un fattore che influenza il punto di fusione scelto per la PCR su quel pezzo di DNA. Le basi A-T e G-C si accoppiano nel legame a doppio filamento tra loro per tenere insieme la struttura a doppio filamento. Più coppie di basi consecutive tra due singoli fili si legano, più anche i loro vicini vogliono legare e più forte diventa l'attrazione tra i due fili. È come una cerniera fatta di piccoli magneti. Quando chiudi la cerniera, i magneti vorranno naturalmente zippare e rimanere con la cerniera.
I magneti più forti si attaccano più strettamente
Un altro fattore che influenza quale temperatura di fusione scegliere per il frammento di DNA di interesse è la quantità di coppie di basi G-C presenti in quel frammento. Ogni coppia di basi è come due mini-magneti che si attraggono. Una coppia composta da G e C è attratta molto più fortemente di una coppia A e T. Quindi un pezzo di DNA che ha più coppie G-C di un altro frammento richiederà una temperatura più elevata prima di fondersi in singoli filamenti. Il DNA assorbe naturalmente la luce ultravioletta - alla lunghezza d'onda di 260 nanometri, per essere precisi - e il DNA a singolo filamento assorbe più luce rispetto al DNA a doppio filamento. Quindi misurare la quantità di luce assorbita è un modo per misurare quanto il tuo DNA a doppio filamento si è fuso in singoli filamenti. L'effetto "cerniera magnetica" delle coppie di basi G-C e A-T è ciò che fa sì che un grafico dell'assorbanza della luce del DNA a doppio filamento tracciato contro un aumento della temperatura sia sigmoidale, a forma di S, e non una linea retta. La curva della S rappresenta la resistenza del lavoro di squadra che le coppie di basi esercitano contro il caldo perché non vogliono separarsi.
Il punto a metà strada
La temperatura alla quale una parte di DNA si scioglie in singoli filamenti è chiamata la sua temperatura di fusione, che è indicata con l'abbreviazione "Tm". Indica la temperatura alla quale metà del DNA in una soluzione si è fuso in singoli filamenti e l'altra metà è ancora in forma di doppio filo. La temperatura di fusione è diversa per ogni frammento di DNA. Il DNA dei mammiferi ha un contenuto di G-C del 40%, il che significa che il restante 60% delle coppie di basi sono As e Ts. Il suo contenuto di G-C al 40% fa sciogliere il DNA dei mammiferi a 87 gradi Celcius (circa 189 Fahrenheit). Questo è il motivo per cui il primo passo della PCR sul DNA dei mammiferi è di riscaldarlo a 94 gradi Celcius (201 Fahrenheit). Solo sette gradi più caldo della temperatura di fusione e tutti i doppi fili si scioglieranno completamente in singoli fili.