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Il Western Blotting è una delle procedure più comuni nei laboratori biochimici. Fondamentalmente, separa le proteine da un campione per dimensione, quindi esegue il test utilizzando anticorpi per determinare se è presente una determinata proteina. È utile non solo nella ricerca ma anche nei laboratori medici o diagnostici; i test sia per l'HIV che per la malattia di Lyme, ad esempio, comportano un test del saggio di immunoassorbimento enzimatico (ELISA), seguito da una macchia Western se l'ELISA risulta positivo. Nonostante la sua popolarità, tuttavia, la macchia occidentale presenta diversi svantaggi.
Nonquantitative
Le macchie occidentali classiche non sono quantitative. In altre parole, mentre possono dire ai ricercatori se è presente una particolare proteina, non consentono di quantificare la quantità di proteina presente. Alcune aziende di biotecnologie ora vendono kit che consentono ai ricercatori o ai tecnici di laboratorio di quantificare la quantità di proteine presenti utilizzando una curva standard, ma questo funziona solo se sono disponibili campioni puri della stessa proteina. Inoltre, il peso molecolare di una proteina può essere stimato solo con il Western blot, piuttosto che determinarlo esattamente come con la spettrometria di massa.
anticorpi
Una macchia Western può essere eseguita solo se sono disponibili anticorpi primari contro la proteina di interesse. Mentre gli anticorpi per molte proteine diverse sono disponibili presso le aziende biotecnologiche, non sono economici; se gli anticorpi primari non sono disponibili per una determinata proteina, non sarà possibile eseguire una macchia occidentale alla ricerca di quella particolare proteina. Inoltre, i ricercatori potrebbero voler determinare se una proteina è stata modificata in qualche modo - se è stata fosforilata (con un gruppo fosfato attaccato ad essa), per esempio - e con la tecnica Western Blot hanno bisogno di anticorpi specifici per la modifica proteina.
Formazione
Può essere impegnativo eseguire correttamente una macchia occidentale e ottenere buoni risultati, quindi il personale deve essere ben addestrato.In questo come in molto altro, l'esperienza è forse il miglior tutor; anche per un tecnico esperto, tuttavia, una macchia occidentale richiede tempo. La parte di elettroforesi su gel dell'esperimento, ad esempio, richiederà in genere da una a due ore per l'esecuzione. Altre attività possono essere eseguite mentre il gel è in funzione, ovviamente, ma l'esperimento impiega ancora un po 'di tempo per ottenere risultati.
Altre limitazioni
A volte gli anticorpi possono presentare un legame fuori bersaglio, il che può portare a risultati peggiori. Inoltre, con Western blotting, usi un anticorpo contro una specifica proteina, quindi i tuoi risultati ti diranno solo se quella proteina era presente. La spettrometria di massa ad alta risoluzione, al contrario, rivela tutte le proteine presenti in un campione e, a differenza della classica western blot, è quantitativa. È importante ricordare, ovviamente, che la spettrometria di massa è molto più costosa e anche tecnicamente più impegnativa da usare rispetto alla macchia occidentale.