Contenuto
- L'elettroforesi ha un'analisi dei campioni limitata
- Le misure di elettroforesi non sono precise
- È richiesto un campione iniziale sostanziale
- È possibile visualizzare solo alcune molecole
- L'elettroforesi ha un rendimento basso
L'elettroforesi su gel è una tecnica in cui le molecole biologiche sono separate l'una dall'altra e identificate nella ricerca biologica o nella diagnostica medica. Fin dal loro sviluppo negli anni '70, queste tecniche sono state preziose per identificare i geni (DNA) e i prodotti genici (RNA e proteine) di interesse per la ricerca. Negli ultimi anni sono emerse nuove tecniche che danno maggiore specificità e dettagli su ciò che sta accadendo nei sistemi viventi. Mentre questi non hanno soppiantato le tecniche di elettroforesi e le manipolazioni avanzate possono espandere la vitalità della tecnica, è importante rendersi conto di ciò che l'elettroforesi su gel può e non può fare.
L'elettroforesi ha un'analisi dei campioni limitata
L'elettroforesi è specifica per qualsiasi tessuto che hai campionato. Ad esempio, se si esegue una macchia del sud (un tipo di elettroforesi) su un tampone di guancia, si stanno guardando i geni dalle cellule epiteliali della guancia e da nessun'altra parte del corpo. A volte, questo può essere utile, ma i ricercatori sono spesso interessati a effetti più diffusi.
Tecniche come l'ibridazione in situ (ISH) possono prelevare una sezione di tessuto e analizzare l'espressione genica in ciascuna piccola area di quel campione.Pertanto, i ricercatori possono esaminare ogni area del cervello in un campione con ISH, mentre le tecniche di elettroforesi possono esaminare solo alcune aree alla volta.
Le misure di elettroforesi non sono precise
L'elettroforesi su gel può separare efficacemente proteine simili con pesi diversi (questa è una tecnica chiamata Western blotting). Può separarli più precisamente attraverso una tecnica nota come elettroforesi 2d; questo è comune in proteomica.
Sfortunatamente, tutte le misurazioni effettuate con questa tecnica sono nella migliore delle ipotesi semiquantitative. Per ottenere la massa (peso) precisa delle proteine, la spettroscopia di massa deve essere impiegata dopo che la proteina è stata purificata mediante elettroforesi. Inoltre, il confronto delle quantità relative di diverse molecole si basa sulla densità di banda (oscurità) di diversi punti sul gel. Questo metodo presenta un certo grado di errore e di solito i campioni vengono eseguiti più volte per ottenere risultati chiari.
È richiesto un campione iniziale sostanziale
L'elettroforesi è una tecnica per isolare e identificare visivamente diverse biomolecole. Questo viene fatto facendo passare una corrente elettrica attraverso il gel per separare molecole cariche di pesi diversi. Se la molecola a cui sei interessato non è abbastanza comune, la sua banda sarà praticamente invisibile e difficile da misurare.
Il DNA e l'RNA possono essere leggermente amplificati prima di eseguire l'elettroforesi, ma non è pratico farlo con le proteine. Pertanto, è necessario un ampio campione di tessuto per eseguire questi test. Ciò può limitare l'utilità della tecnica, soprattutto nell'analisi medica. È praticamente impossibile eseguire elettroforesi su campioni da una singola cella; citometria a flusso e immunoistochimica sono più comunemente usati per valutare l'espressione cellula-cellula delle proteine. Una tecnica chiamata PCR è eccellente per misurare con precisione piccole quantità di RNA.
È possibile visualizzare solo alcune molecole
L'elettroforesi è eccellente nel separare e identificare biomolecole di medie e grandi dimensioni. Tuttavia, molte delle molecole che i ricercatori desiderano guardare sono più piccole; piccoli ormoni, neurotrasmettitori e ioni non possono essere misurati mediante elettroforesi. Questo per due motivi: non reagiscono correttamente con la preparazione dell'elettroforesi (di solito una tecnica chiamata SDS PAGE) e, anche se lo facessero, sono troppo piccoli per separarsi correttamente e si precipiterebbero fuori dal fondo del gel. Queste molecole vengono invece misurate mediante tecniche come i RIAA (test radioimmunologici) e gli ELISA (test di immunoassorbimento enzimatico).
L'elettroforesi ha un rendimento basso
L'elettroforesi su gel ha generalmente un rendimento basso, il che significa che non produce dati in modo particolarmente rapido. Elettroforesi a contrasto, in cui è possibile esaminare una manciata di molecole di RNA alla volta, con PCR (reazione a catena della polimerasi), che può valutare simultaneamente migliaia di campioni. Allo stesso modo, la citometria a flusso può eseguire misurazioni da migliaia di singole cellule e creare correlazioni complesse, mentre l'elettroforesi esamina le cellule in massa e non può fare discriminazioni così fini. La PCR e la citometria a flusso rappresentano rispettivamente processi fortemente paralleli e seriali, ed entrambi superano di gran lunga le capacità dell'elettroforesi di generare dati di ricerca.