Contenuto
- Che cos'è l'elettroforesi su gel?
- Componenti dell'elettroforesi
- Modellare il gel
- Come funziona l'elettroforesi?
- Carica e dimensioni Determinano le bande di DNA
- Applicazioni e usi dell'elettroforesi
L'elettroforesi su gel, spesso chiamata anche elettroforesi del DNA o semplicemente elettroforesi, è una tecnica che viene utilizzata per separare frammenti di DNA (e altre molecole cariche) in base alle dimensioni. Questo viene tipicamente fatto usando gel di agarosio e carica elettrica per separare i frammenti l'uno dall'altro.
Questa tecnica ha alcune applicazioni tra cui l'esame del DNA, la diteggiatura del DNA, la criminologia e anche varie applicazioni mediche.
Che cos'è l'elettroforesi su gel?
L'elettroforesi su gel è una tecnica che consente agli scienziati di separare le molecole cariche in base alle dimensioni. Questo include DNA, RNA e proteine.
Ricorda, il DNA e l'RNA hanno una leggera carica negativa grazie alle molecole di ossigeno caricate negativamente nella spina dorsale zucchero-fosfato della molecola. Le proteine possono avere una serie di cariche a seconda degli aminoacidi all'interno della catena polipeptidica.
Componenti dell'elettroforesi
Per eseguire l'elettroforesi, prima è necessario realizzare il gel. Questo può essere fatto in quasi tutti i laboratori; i gel di agarosio sono più comuni. Per produrre il gel, la polvere di agarosio viene miscelata con un apposito tampone chiamato tampone per elettroforesi. Questa miscela viene quindi riscaldata fino a quando l'agarosio non viene sciolto e completamente miscelato nella soluzione tampone.
Si noti che alcuni protocolli di elettroforesi richiedono l'aggiunta di bromuro di etidio (Et-Br). Questo colora qualsiasi DNA utilizzato nell'elettroforesi per consentire di visualizzare la posizione dei frammenti alla luce UV.
Modellare il gel
Questo viene quindi versato in uno stampo rettangolare chiamato vassoio di fusione in gel. Insieme allo stampo che crea il gel rettangolare utilizzato per l'elettroforesi, un pettine viene posizionato su una delle estremità del gel. Questo pettine crea i pozzetti in cui vengono caricati i campioni che si desidera separare mediante elettroforesi. Puoi vedere una foto qui.
Una volta che il gel si è indurito, il pettine viene rimosso e il gel viene inserito in un apposito serbatoio per elettroforesi. Un altro tampone viene riempito nel serbatoio fino a quando un leggero strato di tampone copre completamente il gel di agarosio.
Questo serbatoio produce una corrente elettrica (compresa tra 50 e 150 V) attraverso la soluzione tampone e, a sua volta, attraverso il gel di agarosio. I pozzetti del gel di agarosio sono posti all'estremità negativa della corrente (il catodico) con l'altra estremità del gel all'estremità positiva della corrente (il anodo).
Come funziona l'elettroforesi?
Prima che la corrente elettrica attraversi il serbatoio e il gel, i campioni vengono caricati nei pozzetti. Questo viene fatto usando una micropipetta. Un campione "marcatore", noto anche come scala del DNA, è un campione con dimensioni note di frammenti di DNA che possono aiutarti a confrontare i tuoi campioni e comprendere le dimensioni del campione che stai testando.
Spesso a colorante di tracciamento (chiamato anche colorante di caricamento) viene aggiunto a ciascun campione per consentire di caricare il campione nei pozzetti. Il colorante ti aiuta anche a monitorare il movimento dei campioni attraverso il gel.
Quindi, in che modo i campioni si muovono nel gel e si separano per dimensione? Ha a che fare con il corrente elettrica che attraversa il gel di agarosio insieme al dimensione / struttura dei frammenti e gel di agarosio.
Carica e dimensioni Determinano le bande di DNA
Ricorda che nel complesso, la carica del DNA è negativo . Quindi, quando questi campioni vengono posizionati in pozzetti vicini all'estremità negativa della corrente elettrica, questo causerà lo spostamento del DNA caricato negativamente lontano dal catodo (carica negativa) e mossa verso l'anodo (carica positiva) all'estremità opposta.
Oltre a questo movimento dei campioni, l'elettroforesi separa anche i campioni e i frammenti in quei campioni per dimensione. Questo è perché molecole più piccole e i frammenti possono Muoviti più veloce e più facilmente attraverso il gel mentre molecole più grandi e frammenti muoviti più lentamente. Ciò significa che piccoli frammenti si sposteranno all'estremità del gel più rapidamente di quelli più grandi e, di conseguenza, separano ogni frammento per dimensione.
Dopo aver eseguito il gel per circa un'ora (nella maggior parte dei protocolli), la carica viene disattivata e il gel viene analizzato. Vedrai una distinta banda rettangolare, spesso chiamata banda DNA o banda proteica, in vari punti lungo il gel. Ogni banda rappresenta un frammento che si è spostato lungo il gel.
Applicazioni e usi dell'elettroforesi
Ci sono molte applicazioni per l'elettroforesi in laboratorio. Qui ci sono solo alcuni: