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Quando si lavora con cromatografia liquida ad alte prestazioni (HPLC), una buona calibrazione è assolutamente essenziale per garantire risultati affidabili e di qualità. La corretta calibrazione di uno strumento HPLC inizia con la creazione di uno standard di calibrazione adeguato. Nella maggior parte dei casi, la calibrazione richiede infatti una serie di standard di concentrazione crescente per produrre quella che è nota come curva di calibrazione. Questa è una linea tracciata e un'equazione associata che descrive la relazione tra la concentrazione della sostanza chimica da testare e la risposta del rivelatore HPLC.
Determinare la sostanza chimica che si desidera testare per l'utilizzo dell'HPLC (l '"analita"). Ad esempio, potresti voler testare una serie di bevande analcoliche per il contenuto di fruttosio, nel qual caso il fruttosio sarebbe l'analita.
Ottenere una quantità della sostanza chimica analita di purezza adeguata. Normalmente la purezza dovrebbe essere superiore al 99% e l'analita dovrebbe essere acquistato da una rinomata azienda di approvvigionamento chimico. Nel caso del fruttosio, ad esempio, acquisteresti il fruttosio puro da un rivenditore di prodotti chimici e non da un negozio di alimentari.
Determinare le concentrazioni massime e minime previste dell'analita nei campioni che si intende testare sull'HPLC. Nel caso di bevande analcoliche, esamineresti le etichette delle bevande e determineresti il contenuto di fruttosio più basso e più alto tra le bevande che testerai. Tenere presente che il campione iniziale (la bibita analcolica) può essere diluito o altrimenti manipolato durante la preparazione per l'analisi (a seconda del metodo HPLC utilizzato) e quindi la concentrazione dell'analita nei campioni effettivamente iniettati sull'HPLC può essere modificata. È la concentrazione dell'analita nei campioni eseguita sull'HPLC che deve essere considerata.
Determina il solvente in cui dissolverai l'analita per creare gli standard di calibrazione. Questo solvente deve essere in grado di dissolvere correttamente l'analita in un intervallo di concentrazione relativamente ampio (almeno alto come nei campioni che si intende testare). Inoltre, questo solvente dovrebbe idealmente essere abbastanza simile alla "fase mobile:" il solvente utilizzato per trasportare campioni attraverso lo strumento HPLC.
Calcola la quantità di analita richiesta per realizzare una soluzione "standard di scorta" dell'analita. Ciò si ottiene moltiplicando la concentrazione richiesta dello standard di scorta per il volume desiderato. La concentrazione dell'analita in questa soluzione dovrebbe essere almeno del 10% superiore alla concentrazione del campione più alta prevista. Se la massima concentrazione prevista di fruttosio in un campione di bibite analcoliche è di 8 grammi / 100 millilitri, lo standard di base potrebbe essere portato a una concentrazione di 10 grammi di fruttosio / 100 millilitri. Un volume ragionevole è di 500 millilitri, quindi sarebbero necessari 8/100 ml x 500 ml = 40 grammi di fruttosio.
Pesare la quantità richiesta di analita con un livello adeguato di precisione. Spesso è adatto un valore di peso in grammi preciso a uno o due decimali, ma per alcuni metodi potrebbe essere necessaria una maggiore precisione.
Trasferire l'analita pesato in un pallone volumetrico del volume necessario e aggiungere il solvente desiderato al segno di riempimento sul pallone. L'uso di un matraccio tarato (piuttosto che un becher graduato, ad esempio) aumenta la precisione del valore di concentrazione standard dello stock. Accertarsi che tutto l'analita sia trasferito nel matraccio; usare un po 'del solvente per lavarlo, se necessario.
Bloccare il matraccio tarato e agitare o invertire delicatamente fino a quando l'analita non si è completamente sciolto.
Effettuare una serie di diluizioni variabili dello standard di stock trasferendo volumi noti dello standard di stock in matracci tarati, usando pipette per un trasferimento accurato, quindi aggiungendo solvente. La concentrazione standard più bassa dovrebbe essere inferiore al campione più basso previsto da analizzare. Nell'esempio di bibita analcolica, se la concentrazione di fruttosio prevista più bassa in un campione è 2 grammi / 100 ml, si potrebbe creare uno standard da 1 grammo / 100 ml. Ciò avverrebbe mediante una diluizione di dieci volte dello standard azionario. Le serie standard dovrebbero includere un totale di 5 o 6 concentrazioni, quindi sarebbero necessarie ulteriori diluizioni per produrre standard di forse 3, 5 e 8 grammi di fruttosio / ml. Ora hai una serie di soluzioni standard con cui calibrare l'HPLC.