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Il blu genetico di una cellula è codificato nel suo materiale genetico o DNA. Poiché il DNA non lascia mai il nucleo della cellula, affinché queste informazioni entrino nel citoplasma dove risiedono altre proteine e componenti biochimiche, è necessario prima trascrivere il DNA in RNA messaggero (mRNA o RNA poli (A)). Questo mRNA viene quindi tradotto in proteine che svolgono molte funzioni della cellula. Per rilevare o quantificare mRNA molto rari, fare sonde per microarray o costruire librerie di molecole di DNA complementari, l'mRNA deve essere isolato. Tuttavia, l'estrazione totale di RNA (cioè tutto l'RNA in una cellula) e il successivo isolamento dell'mRNA non sono processi reciprocamente esclusivi; il primo deve essere eseguito per estrarre l'mRNA.
Isolamento di mRNA da RNA totale
Omogeneizzazione di TRIzol: l'RNA totale include tutti gli mRNA, l'RNA di trasferimento, l'RNA ribosomiale e altri RNA non codificanti. Per separarli da altri componenti cellulari, la cella viene prima aperta per rilasciare il suo contenuto. Questo viene fatto risospendendo le cellule pellettizzate mediante centrifugazione (filatura ad alta velocità) in TRIzol Reagent (Life Technologies). Altre versioni di TRIzol (come il reagente TRI di Ambion) funzionano in modo simile.
Isolamento totale dell'RNA: una serie di centrifugazioni viene utilizzata per separare i diversi componenti (proteine, DNA, RNA) della cellula in strati o fasi, all'interno della sospensione. La fase superiore di colore giallo è composta da grasso e può essere scartata. La fase desiderata è colorata di rosso, contiene l'RNA totale e viene mantenuta. Dopo aver eseguito un'estrazione fenolo-cloroformio e una serie di lavaggi con alcool usando isopropanolo ed etanolo, l'RNA può essere pellettato per l'isolamento dell'mRNA. Aggiungi inibitori di RNase per impedire a questo enzima di degradare l'RNA totale.
Estrazione di mRNA: è comune utilizzare un kit per isolare gli mRNA, poiché i protocolli di laboratorio fatti in casa non generano grandi quantità di mRNA altamente purificati. I kit commerciali includono il FastTrack 2.0 di Invitrogen o il kit di isolamento mRNA puro Poly (A) di Ambion. Questi passaggi di base sono comuni a tali kit:
a) Miscelare il tampone di lisi inibito da RNase fornito nel kit con un massimo di 300 microlitri di RNA totale.
b) Riscaldare per 5 minuti a 65 gradi Celsius e quindi raffreddare immediatamente il campione su ghiaccio per un minuto.
c) Mescolare questo con 0,5 M di cloruro di sodio e quindi dissolvere completamente Oligo dT (acido oligodeossimossimidilico) in questo campione.
d) Centrifugare questo campione e recuperare il surnatante, che viene lavato più volte in una serie di tamponi leganti e a basso contenuto di sale forniti nei kit.
e) Eluire l'mRNA più volte fino ad ottenere un volume specificato dal kit (ad es. 500 microlitri).
f) Precipitare l'eluato mediante precipitazione con acetato di sodio ed etanolo. Risospendere fino a 20 microlitri di acqua trattata con dietilpyrocarbonato (DEPC).
g) Conservare a -80 gradi Celsius e verificare la qualità e la quantità mediante spettrofotometria.