Contenuto
- Clonazione del DNA: definizione e panoramica del processo
- Il metodo vettoriale plasmide
- Il metodo PCR (reazione a catena della polimerasi)
- Usando insieme i metodi di clonazione di Plasmid Vector e PCR DNA
- Esempi di clonazione del DNA per la biotecnologia
- Esempi di clonazione del DNA per la ricerca
- Esempi di clonazione del DNA per la terapia genica
È possibile clonare interi organismi come la pecora Dolly, ma la clonazione del DNA è diversa. Usa tecniche di biologia molecolare per fare copie identiche di sequenze di DNA o singoli geni.
Usando metodi di ingegneria genetica, i segmenti del codice genetico del DNA vengono identificati e isolati. La clonazione del DNA quindi copia le sequenze di acido nucleico nei segmenti.
Le copie identiche risultanti possono essere utilizzate per ulteriori ricerche o per applicazioni biotecnologiche. Spesso il gene che viene copiato codifica una proteina che può far parte di trattamenti medici. Tecnologia del DNA incluso Clonazione del DNA sta supportando la comprensione di come funzionano i geni e di come il codice genetico umano influenza il funzionamento del corpo.
Clonazione del DNA: definizione e panoramica del processo
La clonazione del DNA è il processo di biologia molecolare per fare copie identiche di segmenti di DNA situati nei cromosomi che contengono il codice genetico degli organismi avanzati.
Il processo genera grandi quantità di sequenze di DNA target. Lo scopo della clonazione del DNA è produrre da soli le sequenze di DNA target o produrre le proteine codificate nelle sequenze di target.
Vengono chiamati i due metodi utilizzati nella clonazione del DNA vettore plasmide e reazione a catena della polimerasi (PCR). Nel vettore plasmide metodo, i fili di DNA vengono tagliati usando enzimi di restrizione per produrre frammenti di DNA e i segmenti risultanti vengono inseriti in vettori di clonazione chiamati plasmidi per ulteriore duplicazione. I plasmidi sono collocati in cellule batteriche che producono quindi copie del DNA o proteine codificate.
Nel Metodo PCR, il segmento di filamenti di DNA da duplicare è contrassegnato con gli enzimi chiamati primer. Un enzima polimerasi crea copie della parte marcata del filamento di DNA. Questo metodo non utilizza enzimi di restrizione e può produrre DNA clonato da piccoli campioni. A volte i due metodi di tecnologia del DNA sono usati insieme per incorporare le migliori caratteristiche di ciascuno in una reazione globale.
Il metodo vettoriale plasmide
Il vettore del metodo si riferisce al plasmide utilizzato per trattenere il segmento di DNA bersaglio da clonare. I plasmidi sono piccoli fili circolari di DNA non cromosomico trovato in molti organismi tra cui batteri e virus.
I plasmidi batterici sono il vettore utilizzato per inserire il segmento di DNA bersaglio nelle cellule batteriche per un'ulteriore duplicazione.
Selezione e isolamento del DNA target: Prima che possa iniziare il processo di clonazione del DNA, è necessario identificare le sequenze di DNA, in particolare l'inizio e la fine dei segmenti di DNA.
Tali sequenze di DNA possono essere trovate usando il DNA clonato esistente con sequenze note o studiando la proteina prodotta dalla sequenza di DNA bersaglio. Una volta nota la sequenza, è possibile utilizzare gli enzimi di restrizione corrispondenti.
Taglio del DNA target con enzimi di restrizione: Gli enzimi di restrizione sono selezionati per cercare il codice DNA all'inizio e alla fine delle sequenze target.
Quando gli enzimi di restrizione trovano una sequenza codificata speciale di coppie di basi chiamate siti di restrizione, si attaccano al DNA in quella posizione e si avvolgono attorno alla molecola di DNA, recidendo il filo. I segmenti di DNA tagliati contenenti la sequenza target sono ora disponibili per la duplicazione.
Scelta del vettore plasmidico e inserimento del DNA target: Un plasmide adatto contiene idealmente le stesse sequenze di codifica del DNA del filamento di DNA da cui è stato tagliato il DNA bersaglio. Il filamento di DNA circolare del plasmide viene tagliato con gli stessi enzimi di restrizione utilizzati per tagliare il DNA bersaglio.
UN Enzima di DNA ligasi viene utilizzato per promuovere il collegamento del segmento di DNA e le estremità del segmento di DNA bersaglio si collegano con le estremità tagliate del DNA del plasmide. Il DNA bersaglio ora fa parte del filamento circolare di DNA plasmidico.
Inserimento del plasmide in una cellula batterica: Una volta che il plasmide contiene la sequenza di DNA da clonare, la clonazione effettiva può avvenire usando un processo chiamato trasformazione batterica. I plasmidi vengono inseriti in una cellula batterica come E. coli e le cellule con i nuovi segmenti di DNA inizieranno a produrre copie e le proteine corrispondenti.
Nella trasformazione batterica, le cellule ospiti e i plasmidi vengono incubati insieme a temperatura corporea per circa 12 ore. Le cellule assorbono alcuni dei plasmidi e li trattano come il proprio DNA plasmidico.
Raccolta del DNA clonato e delle proteine: La maggior parte dei plasmidi utilizzati per la clonazione del DNA hanno geni di resistenza agli antibiotici incorporato nel loro DNA. Mentre le cellule batteriche assorbono i nuovi plasmidi, diventano resistenti agli antibiotici.
Quando la coltura viene trattata con antibiotici, sopravvivono solo quelle cellule che hanno assorbito i nuovi plasmidi. Il risultato è una pura coltura di cellule batteriche con DNA clonato. Quel DNA può quindi essere raccolto o la proteina corrispondente può essere prodotta.
Il metodo PCR (reazione a catena della polimerasi)
Il metodo PCR è più semplice e copia il DNA esistente in atto. Non richiede il taglio con enzimi di restrizione o l'inserimento di sequenze di DNA plasmidico. Ciò lo rende particolarmente adatto per la clonazione di campioni di DNA con un numero limitato di filamenti di DNA. Mentre il metodo può clonare il DNA, non può essere utilizzato per la produzione della proteina corrispondente.
Srotolando i filamenti di DNA: Il DNA nei cromosomi è strettamente arrotolato in una struttura a doppia elica. Riscaldare il DNA a 96 gradi Celsius in un processo chiamato denaturazione rende la molecola di DNA srotolata e separata in due filamenti. Questa separazione è necessaria perché è possibile clonare solo un singolo filamento di DNA alla volta.
Selezione dei primer: Come per la clonazione del DNA vettoriale plasmidico, le sequenze di DNA da clonare devono essere identificate con particolare enfasi sugli inizi e sulle estremità dei segmenti di DNA. I primer sono enzimi che si attaccano a specifiche sequenze di codici del DNA e devono essere selezionati per contrassegnare i segmenti di DNA target. I primer giusti si attaccheranno alle sequenze di molecole di DNA per segnare l'inizio e la fine dei segmenti target.
Ricottura della reazione per legare i primer: Viene chiamato il raffreddamento della reazione a circa 55 gradi Celsius ricottura. Mentre la reazione si raffredda, i primer vengono attivati e si attaccano al filamento di DNA ad ogni estremità di un segmento di DNA bersaglio. Gli inneschi agiscono solo come marcatori e non è necessario tagliare il filamento di DNA.
Produrre copie identiche del segmento di DNA target: In un processo chiamato estensione, l'enzima TAQ polimerasi sensibile al calore viene aggiunto alla reazione. La reazione viene quindi riscaldata a 72 gradi Celsius, attivando l'enzima. L'enzima DNA polimerasi attivo si lega ai primer e copia la sequenza di DNA tra loro. Il processo iniziale di sequenziamento e clonazione del DNA è completo.
Aumentare la resa del DNA clonato: Il processo iniziale di ricottura ed estensione crea relativamente poche copie dei segmenti di filamento di DNA disponibili. Per aumentare la resa attraverso un'ulteriore replicazione del DNA, la reazione viene nuovamente raffreddata per riattivare i primer e lasciarli legare ad altri filamenti di DNA.
Quindi, riscaldando nuovamente la reazione si attiva nuovamente l'enzima polimerasi e vengono prodotte più copie. Questo ciclo può essere ripetuto da 25 a 30 volte.
Usando insieme i metodi di clonazione di Plasmid Vector e PCR DNA
Il metodo del vettore plasmidico si basa su un ampio apporto iniziale di DNA per tagliare e inserire nei plasmidi. Una quantità insufficiente di DNA originale provoca un minor numero di plasmidi e un lento avvio della produzione di DNA clonato.
Il metodo PCR può produrre una grande quantità di DNA da pochi filamenti di DNA originali, ma poiché il DNA non è impiantato in una cellula batterica, la produzione di proteine non è possibile.
Per produrre la proteina codificata nei frammenti di DNA da clonare da un piccolo campione iniziale di DNA, i due metodi possono essere usati insieme e possono si completano a vicenda. Innanzitutto il metodo PCR viene utilizzato per clonare il DNA da un piccolo campione e produrre molte copie.
Quindi i prodotti PCR vengono utilizzati con il metodo del vettore plasmidico per impiantare il DNA prodotto in cellule batteriche che produrranno la proteina desiderata.
Esempi di clonazione del DNA per la biotecnologia
La biologia molecolare utilizza la clonazione genica e la replicazione del DNA per scopi medici e commerciali. I batteri con sequenze di DNA clonato vengono utilizzati per produrre medicinali e sostituire sostanze che le persone con disordini genetici non possono produrre da sole.
Gli usi tipici includono:
La biotecnologia utilizza anche la clonazione genica in agricoltura per creare nuove caratteristiche nelle piante e negli animali o migliorare le caratteristiche esistenti. Man mano che vengono clonati più geni, il numero di possibili usi aumenta esponenzialmente.
Esempi di clonazione del DNA per la ricerca
Le molecole di DNA costituiscono una piccola frazione del materiale in una cellula vivente ed è difficile isolare le influenze di molti geni. I metodi di clonazione del DNA forniscono grandi quantità di una specifica sequenza di DNA per lo studio e il DNA sta producendo proteine proprio come nella cellula originale. La clonazione del DNA consente di studiare questa operazione per diversi geni in isolamento.
La ricerca tipica e le applicazioni della tecnologia del DNA comprendono l'esame:
Quando vengono clonate più sequenze di DNA, è più facile trovare e clonare sequenze aggiuntive. I segmenti di DNA clonati esistenti possono essere utilizzati per determinare se un nuovo segmento corrisponde a quello vecchio e quali parti sono diverse. L'identificazione di una sequenza di DNA target è quindi più veloce e più accurata.
Esempi di clonazione del DNA per la terapia genica
Nel terapia genetica, un gene clonato viene presentato alle cellule di un organismo il cui gene naturale è danneggiato. Un gene vitale che produce una proteina richiesta per una specifica funzione dell'organismo potrebbe essere mutato, modificato dalle radiazioni o influenzato dai virus.
Quando il gene non funziona correttamente, nella cellula manca una sostanza importante. La terapia genica ci prova sostituire il gene con una versione clonata che produrrà la sostanza richiesta.
La terapia genica è ancora sperimentale e pochi pazienti sono stati curati con la tecnica. I problemi risiedono nell'identificazione del singolo gene responsabile di una condizione medica e nella consegna di molte copie del gene alle cellule giuste. Poiché la clonazione del DNA è diventata più diffusa, la terapia genica è stata applicata in diverse situazioni specifiche.
Le recenti applicazioni di successo hanno incluso:
La terapia genica è una delle applicazioni più promettenti della clonazione del DNA, ma è probabile che altri nuovi usi proliferino quando vengono studiate più sequenze di DNA e viene determinata la loro funzione. La clonazione del DNA fornisce la materia prima per l'ingegneria genetica nelle quantità necessarie.
Quando il ruolo dei geni è noto e la loro corretta funzione può essere garantita mediante la sostituzione di geni difettosi, molte malattie croniche e persino il cancro possono essere attaccati e curati a livello genetico usando la tecnologia del DNA.
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