Secondo il sito Web della BioWeb dell'Università di Wisconsins, un primer per PCR è un oligonucleotide sintetico breve (di solito lungo tra le 18 e le 25 basi) utilizzato per amplificare regioni specifiche del DNA in una tecnica di biologia molecolare nota come reazione a catena della polimerasi (PCR). Sono necessari sia un primer in avanti che uno invertito, progettati per essere complementi inversi del filamento di DNA, per fiancheggiare e legarsi alla regione di DNA desiderata. Quando gli scienziati vogliono eseguire ricerche su un gene o una regione specifica del DNA, devono prima eseguire la PCR per acquisire abbastanza della regione target con cui lavorare. La progettazione di sequenze di primer per la regione di interesse può essere necessaria se non sono già disponibili tramite ricerche precedentemente pubblicate o con mezzi commerciali.
Ottieni la sequenza nucleotidica del gene o della regione del DNA di interesse e decidi per quanto tempo si desidera amplificare un frammento. Il primer avanti e indietro è progettato per legarsi all'inizio e alla fine del frammento desiderato. In genere, i metodi PCR convenzionali utilizzano primer che fiancheggiano una regione compresa tra 100 e 1.000 coppie di basi lunghe, mentre i metodi PCR in tempo reale utilizzano frammenti lunghi tra 50 e 200 coppie di basi.
Decidi dove nella sequenza vuoi che siano i primer. Ad esempio, potresti desiderare la posizione vicino all'estremità 5 o 3 della sequenza o nel mezzo. Se lo si desidera, designare la posizione dei primer per estendere un introne.
Seguire le linee guida consigliate per la progettazione del primer. L'amplificazione corretta del prodotto DNA dipende dalla qualità dei primer e alcune variabili sono fondamentali.
Progettare i primer con una lunghezza compresa tra 18 e 24 basi. Vincent R. Prezioso, Ph.D., della Brinkmann Instruments Inc., suggerisce che questa lunghezza è abbastanza lunga da essere estremamente specifica per la regione del DNA desiderata, ma abbastanza corta da legare (ricottura) facilmente. La temperatura di fusione del primer (Tm) dovrebbe essere compresa tra 55 e 80 gradi Celsius, abbastanza bassa da consentire una fusione completa a 90 ° C o superiore, ma abbastanza alta da consentire la ricottura. Il contenuto di GC (percentuale di G e C nella sequenza) dovrebbe essere compreso tra il 40 e il 60 percento. L'estremità 3 della sequenza di primer dovrebbe terminare con una C o una G (chiamata pinza GC) per promuovere il legame, poiché i nucleotidi G e C hanno legami più forti, tuttavia, evitare di avere tre o più G o C nelle ultime cinque basi della sequenza.
Evitare di avere serie di quattro o più di una base (come ACCCC ...) o quattro o più ripetizioni di di-nucleotidi (come ATATATAT ...) perché possono causare errori di stampa.Progettare primer senza omologia intra-primer (più di tre basi che si integrano all'interno dell'uno stesso primer) o omologia inter-primer (in cui il primer forward e reverse hanno sequenze complementari). Ciò può causare auto-dimeri o primer-dimeri, in cui i primer si legano a se stessi invece di legarsi alla sequenza di DNA desiderata.
Utilizza risorse online e siti Web che aiutano nella progettazione di primer o aiutano a controllare le sequenze di primer per l'auto-complementarietà o il potenziale per creare strutture secondarie come le forcine. Alcuni siti web di progettazione di primer includono il Massachusetts Institute of Technologys Primer3, il National Center for Biotechnology Information Primer-Blast e Integrated DNA Technologies OligoAnalyzer.