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La spettrofotometria è uno strumento prezioso in chimica e biologia. L'idea di base è semplice: sostanze diverse assorbono meglio la luce / radiazione elettromagnetica ad alcune lunghezze d'onda rispetto ad altre. Ecco perché alcuni materiali sono trasparenti mentre altri sono colorati, ad esempio. Quando si illumina la luce di una determinata lunghezza d'onda attraverso una soluzione, maggiore è la sua concentrazione, più luce assorbirà. Per calcolare la concentrazione, è necessario confrontare la lettura con le letture per gli standard di concentrazione nota. La procedura di seguito è una procedura abbastanza generica scritta pensando a un laboratorio di insegnamento della chimica, ma può essere modificata anche per altre impostazioni.
Come sempre quando lavori in un laboratorio, indossa occhiali, guanti e cappotto a maniche lunghe per garantire la tua sicurezza.
Spremere il bulbo di gomma per svuotarlo dall'aria, quindi posizionarlo sopra la pipetta graduata e consentire al bulbo di rilassarsi in modo da aspirare l'acqua nella pipetta. Quindi, rimuovere la lampadina e tappare la parte superiore della pipetta con un dito; questo sigillerà la pipetta in modo che la soluzione interna non fuoriesca fino a quando non viene rimosso il dito. Sollevare leggermente il bordo del dito per far fuoriuscire una piccola soluzione dalla pipetta, fino a raggiungere il volume desiderato. Esercitati con un po 'd'acqua e un becher per avere un'idea di come funziona la pipetta graduata. Il link nella sezione Risorse ha un filmato che mostra come usare una pipetta nel caso in cui non ne abbia mai lavorato uno prima.
Etichetta 5 provette come standard 1-5. Puoi etichettarli usando un nastro per mascheratura e una penna o usando un pennarello cancellabile.
Scegli cinque concentrazioni per i tuoi standard. Volete che le concentrazioni standard siano separate l'una dall'altra per circa lo stesso intervallo - ad es. 0,1 molare, 0,2 molare, 0,3 molare, ecc. - e circa nello stesso intervallo di quello che vi aspettate sarà il vostro sconosciuto. Per il momento, usa le seguenti cinque concentrazioni, ma ricorda che dovrai modificarle quando esegui il tuo esperimento:
Standard 1: 0,1 molare Standard 2: 0,2 molare Standard 3: 0,3 molare Standard 4: 0,4 molare Standard 5: 0,5 molare
Quindi, prendere la soluzione standard 1 molare e aggiungere le seguenti quantità alle provette 1-5. Ricorda, questi importi vengono calcolati utilizzando le concentrazioni sopra elencate, quindi potrebbe essere necessario modificarli in base alle necessità quando si esegue il proprio esperimento.
Standard 1: 0,8 millilitri Standard 2: 1,6 millilitri Standard 3: 2,4 millilitri Standard 4: 3,2 millilitri Standard 5: 4 millilitri
Risciacquare la pipetta graduata, quindi trasferire le seguenti quantità di acqua deionizzata:
Standard 1: 7,2 millilitri Standard 2: 6,4 millilitri Standard 3: 5,6 millilitri Standard 4: 4,8 millilitri Standard 5: 4,0 millilitri
Fondamentalmente, l'idea è di portare la quantità di soluzione in ciascun tubo fino a 8 millilitri.
Tappare ciascuna delle provette standard con parafilm e capovolgerle per mescolarle.
Contrassegnare altre cinque provette come "Sconosciuto 1-5". Aggiungi le stesse quantità della tua soluzione sconosciuta o di prova a ciascuna di quelle che hai usato con la soluzione 1 molare per gli standard. In altre parole, lo sconosciuto 1 conterrà 0,8 millilitri di soluzione di prova e 7,2 millilitri di acqua, lo sconosciuto 2 conterrà 1,6 millilitri di soluzione di prova e 6,4 millilitri di acqua, e così via.
Tappa ciascuna delle incognite con il parafilm e capovolgi accuratamente per mescolare.
Accendere lo spettrofotometro e lasciarlo riscaldare. Il tempo necessario dipenderà dal modello e dal produttore.
Impostare la lunghezza d'onda sullo spettrofotometro. La lunghezza d'onda dipenderà dal tipo di sostanza chimica nell'esperimento. Per ora, supponi 500 nm, anche se ricorda che dovrai cambiarlo per diversi esperimenti.
Calibra il tuo spettrofotometro. La procedura di calibrazione varia in base al dispositivo in uso. Per Spectronic 20, un modello comune nei laboratori didattici, prima regolerai la macchina in modo che legga "0 percento T" quando non è caricata alcuna cuvetta, quindi regolala in modo che sia "100% T" quando una cuvetta vuota contenente deionizzata viene caricata solo acqua. Queste procedure possono variare in base al tipo di macchina in uso, quindi consultare le istruzioni del produttore per i dettagli.
Dopo aver calibrato la macchina, prendere la provetta standard 1 e versare il contenuto in una cuvetta pulita fino a raggiungere la linea di riempimento. Pulire la cuvetta con un kimwipe per rimuovere eventuali dita o altro sporco. Inserire la cuvetta nello spettrofotometro e registrare la lettura "% T".
Ripetere questa procedura per tutti e 10 i campioni. ASSICURATI di pulire la cuvetta tra i campioni per assicurarti che i risultati siano il più precisi possibile.
Prendi i risultati per i tuoi standard e inseriscili in un foglio di calcolo / programma grafico come Excel o OpenOffice.
Utilizzando il programma per fogli di calcolo, dividere il 100% per ciascuno dei valori "% T" per gli standard, quindi prendere il registro del risultato. Questo calcolo ti darà l'assorbanza. Se inserisci la formula, il tuo foglio di calcolo farà il calcolo per te.
Esempio: se% T è 50,6, la formula inserita nel programma di foglio di calcolo sarebbe la seguente:
registro (100 / 50.6)
Il programma di foglio di calcolo farà l'aritmetica.
Fai lo stesso per tutti e cinque i valori sconosciuti / sperimentali.
Rappresenta graficamente i valori di assorbanza per tutti e cinque gli standard, con concentrazione sull'asse x e assorbanza sull'asse y. Utilizzando il programma per fogli di calcolo, adattare un'equazione lineare a questo grafico. L'equazione avrà la forma y = mx + b. La maggior parte dei programmi per fogli di calcolo avrà una funzione di regressione lineare. Consultare il manuale dell'utente per il programma di foglio di calcolo per i dettagli su come utilizzare la funzione di regressione lineare.
Prendi l'equazione per la linea più adatta dal tuo programma di fogli di calcolo e risolvila per y sottraendo b da entrambi i lati e dividendo entrambi i lati per m. Il risultato sarà simile al seguente:
(y - b) / m = x
dove b e m sono valori trovati dal tuo programma di fogli di calcolo.
Controlla i valori di assorbanza per le incognite e scegline tre che rientrano nello stesso intervallo degli standard. Utilizzare questi tre valori di assorbanza per i calcoli rimanenti. Se tutti e cinque rientrano nella stessa gamma degli standard, è possibile utilizzare invece tutti e cinque, ma è necessario utilizzarne almeno tre.
Inserisci ciascuno dei tre valori di assorbanza nella tua equazione al posto di y. Ricorda che la tua equazione era nella seguente forma:
(y - b) / m = x
Quindi, si desidera inserire il valore di assorbanza per ogni sconosciuto nell'equazione al posto di y, quindi calcolare x. Puoi utilizzare il programma per fogli di calcolo per fare questo calcolo per te e renderlo più veloce. Ora hai calcolato la concentrazione della sostanza chimica di interesse in tre delle tue incognite diluite. La soluzione originale è stata diluita per preparare queste incognite, tuttavia, quindi ora è necessario lavorare all'indietro e calcolare la concentrazione della soluzione originale in base al fattore di diluizione.
Ogni campione sconosciuto che hai inserito nello spettrofotometro è stato diluito da una quantità diversa. Di conseguenza, ora dovresti dividere la concentrazione calcolata in base all'assorbanza per ciascuna lettura sconosciuta per quanto segue:
Sconosciuto 1: Divide per 0,1 Sconosciuto 2: Divide per 0,2 Sconosciuto 3: Divide per 0,3 Sconosciuto 4: Divide per 0,4 Sconosciuto 5: Divide per 0,5
Ricorda, tuttavia, che queste cifre si basano sul presupposto che stai utilizzando le diluizioni sopra descritte. Ricordarsi di modificare questi valori se i campioni sono stati diluiti di una quantità diversa.
Aggiungi i risultati insieme e dividili per il numero di risultati. Questo ti darà una media. Riporta questo numero come risultato della concentrazione della soluzione originale.