Contenuto
- Vantaggio: sensibilità
- Vantaggio: specificità
- Svantaggio: soggetto a risultati falsi o soggettivi
- Svantaggio: costo elevato e richiesta tecnica
Western blot, una tecnica analitica utilizzata per individuare una specifica proteina in un dato campione, impiega la capacità di un enzima o di un anticorpo primario marcato con fluorescenza di legarsi al suo antigene specifico. Si tratta di un processo in tre fasi che inizia con l'elettroforesi su gel, seguita da tamponamento con membrana e sondaggio con anticorpi. Il rilevamento di proteine può essere diretto o indiretto, con quest'ultimo che utilizza un anticorpo secondario marcato diretto contro il primario. Sebbene accettata come una tecnica di analisi proteica di routine, Western Blot presenta limitazioni e benefici.
Vantaggio: sensibilità
Uno dei maggiori argomenti a favore della macchia occidentale è la sua sensibilità. Grazie alla sua capacità di rilevare fino a 0,1 nanogrammi di proteine in un campione, la tecnica può teoricamente servire da efficace strumento diagnostico precoce, rilevando anche la minima risposta immunogena da un virus o batteri in un campione di paziente. Una macchia occidentale indiretta si basa ulteriormente su questa sensibilità dalla capacità dell'anticorpo secondario di amplificare l'intensità del segnale rilevato dal sistema di imaging. Una maggiore sensibilità significa che sono necessari meno anticorpi per i test, il che riduce significativamente i costi di laboratorio.
Vantaggio: specificità
La tecnica Western Blot deve la sua specificità a due grandi fattori che contribuiscono. Innanzitutto, l'elettroforesi su gel ordina un campione in proteine di dimensioni, carica e conformazione diverse. Questo processo in sé rappresenta un enorme passo in avanti verso il rilevamento, poiché le bande formate nel gel forniscono già indizi sulla dimensione della proteina o del polipeptide di interesse. La specificità dell'interazione anticorpo-antigene funge da secondo grande fattore. Poiché specifici anticorpi mostrano affinità per proteine specifiche, il processo può rilevare selettivamente una proteina bersaglio anche in una miscela di 300.000 proteine diverse.
Svantaggio: soggetto a risultati falsi o soggettivi
Nonostante la sua sensibilità e specificità, una macchia occidentale può ancora produrre risultati errati. Un falso positivo risulta quando un anticorpo reagisce con una proteina non destinata, che è ciò che accade frequentemente quando un paziente sottoposto a test per l'HIV presenta tubercolosi o numerose infezioni parassitarie. Un falso negativo, d'altra parte, può facilmente risultare se alle proteine più grandi non viene dato il tempo sufficiente per trasferirsi correttamente sulla membrana. Macchie e processi non corretti spesso producono bande distorte, sbiadite o anche multiple, rendendo i risultati dei test soggetti all'interpretazione del tecnico.
Svantaggio: costo elevato e richiesta tecnica
Il costo di una western blot è un composto delle grandi spese individuali per anticorpi con tag, analisti esperti e attrezzature di laboratorio. Un processo delicato, il western blotting richiede precisione in ogni fase per la corretta identificazione dei componenti di un campione. Un errore minore nella concentrazione del reagente o nel periodo di incubazione può essere disastroso per l'intero processo. Infine, le apparecchiature necessarie per il rilevamento e l'imaging - sistemi di rivelazione chemiluminescenti, fluorescenti, radioattivi o laser - possono essere troppo costose per l'unità di microbiologia media.