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La cromatografia liquida ad alte prestazioni è una tecnica per l'analisi di laboratorio di una miscela. È un tipo efficiente di cromatografia che utilizza l'alta pressione, piuttosto che la semplice gravità, per spingere un campione di una miscela attraverso una colonna. Viene iniettato un campione, quindi una pompa contenente elevate quantità di pressione aiuta a spostare il campione lungo una colonna impaccata, dove viene separato in singoli componenti. Questa separazione viene quindi analizzata da un rivelatore per ottenere risultati.
Sito di iniezione
Per essere iniettato in un HPLC, un campione deve prima essere dissolto in un solvente liquido polare, preferibilmente uno con spettri HPLC noti in modo che i suoi dati possano essere distinti dai campioni. La soluzione liquida contenente il campione viene posizionata nello strumento e inviata nella colonna. La posizione effettiva del sito di iniezione dipende dalla marca degli strumenti. Nella maggior parte dei casi, il processo di iniezione è automatizzato, ma in alcuni casi un addetto al laboratorio deve iniettare il campione usando un piccolo ago per siringa.
Componente della pompa
Il componente della pompa dell'unità HPLC è necessario perché fornisce la pressione che spinge il campione attraverso la colonna. La forza della pompa varia, ma una potente può produrre una pressione fino a 6.000 psi, o libbre per pollice quadrato, che viene applicata dopo l'iniezione del campione. Ciò consente al campione di passare attraverso la colonna in modo più rapido ed efficiente che se dovesse passare attraverso solo la forza di gravità.
Descrizione della colonna
La maggiore velocità di un campione passato attraverso la colonna da una pompa consente l'uso di un tipo di colonna diverso rispetto a quelli utilizzati nella cromatografia liquida semplice. Il materiale di imballaggio nella colonna può avere una dimensione delle particelle molto più piccola, che aumenta la superficie e quindi aiuta le interazioni del campione con la colonna. La maggior parte delle colonne HPLC funziona attraverso la polarità. Il campione viene sciolto in un solvente polare e la colonna è costituita da idrocarburi in gran parte non polari. Le parti polari della molecola del campione passano attraverso la colonna molto rapidamente perché interagiscono principalmente con il solvente, mentre i componenti non polari del campione rimangono nella colonna, formando interazioni deboli con i componenti della colonna. Pertanto, i componenti dei campioni escono dalla colonna in ordine dal più polare al più non polare.
Funzione rivelatore
I rilevatori variano anche in base al tipo di strumento HPLC utilizzato. Tuttavia, la maggior parte funziona nello stesso modo di base. Una fonte di luce ultravioletta brilla sui componenti separati del campione mentre escono dalla colonna. La maggior parte dei composti organici assorbe una certa quantità di luce, quindi mentre passano dal raggio di luce applicato, un rivelatore può raccogliere quanta luce viene assorbita. Il rilevatore registra inoltre il tempo di ritenzione dei componenti in base all'ordine in cui escono dalla colonna. Questo output può quindi essere analizzato in base all'area del picco per determinare la natura esatta dei componenti dei campioni.