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La cromatografia liquida ad alta prestazione (HPLC) è una tecnica di laboratorio utilizzata per separare e identificare i composti. È un tipo di cromatografia su colonna che si basa su diverse polarità dei composti in una soluzione per separarli. L'HPLC differisce dalla cromatografia su colonna standard perché utilizza la pressione per forzare la soluzione attraverso la colonna più rapidamente e quindi produce risultati più rapidi e talvolta più accurati. L'obiettivo è separare i composti nella colonna e farli uscire separatamente.
Coelution
A causa della velocità dell'HPLC e della sua dipendenza da diverse polarità dei composti, due composti con struttura e polarità simili possono uscire dall'apparato cromatografico contemporaneamente o quasi allo stesso tempo. Questo è noto come coeluizione. La coeluizione rende difficile determinare esattamente quale parte della miscela è stata eluita in quale momento difficile.
Composti adsorbiti
HPLC utilizza in genere una colonna di vetro riempita con perline di materiali diversi. Le miscele forzate attraverso la colonna hanno sostanze chimiche che si legano con diversi punti di forza alle perle. La forza del legame, che dipende dalla somiglianza nella polarità, determina per quanto tempo la sostanza chimica si legherà al tallone prima di essere rilasciata. Alcuni composti si legano così fortemente che essenzialmente non vengono mai rilasciati dai granuli della colonna e non vengono mai misurati nella soluzione che esce dalla colonna.
Costo
Le tecniche tipiche di separazione in laboratorio implicano lo sviluppo di un dosaggio, o metodo di separazione, e quindi l'implementazione di tale dosaggio per separare i singoli composti da una soluzione. Tuttavia, ciò comporta di solito molteplici soluzioni che devono anche essere sottoposte a procedure, portando a un aumento esponenziale della complessità. Sebbene l'HPLC possa spesso semplificare e accelerare questo processo, il costo dello sviluppo di un apparato HPLC può diventare enorme. Lo sviluppo di un apparato HPLC, sebbene molto più efficiente, è molto più costoso rispetto allo sviluppo di altri test per la separazione dei composti. Ciò non lo rende economicamente valido per molti piccoli laboratori privati.
Complessità
L'HPLC non viene utilizzato solo per separare composti semplici, ma anche per isolare proteine specifiche da una miscela cellulare. In questo caso, le perle nella colonna sono generalmente ricoperte di un anticorpo specifico per la proteina che è necessario raccogliere. Le proteine legano gli anticorpi e la soluzione rimanente viene fatta passare attraverso la colonna, quindi le proteine vengono rilasciate usando un'altra soluzione e raccolte. Ciò richiede che un tecnico altamente qualificato controlli la colonna in ogni momento e si assicuri che il processo sia eseguito esattamente come previsto.